Kód:
1B53016
Zarazeni01:
TP1-DP2-P1
lit:
Diagnostika, terapie a prevence nemocí hospodářských zvířat, alimentárních infekcí a zoonóz
Zarazeni02:
TP1-DP2-P1-A
Zarazeni02Text:
a) nové metody diagnostiky patogenů a infekčních chorob hospodářských zvířat,
Zarazeni04:
SMZE2005NPV02
Aktivita:
1B
PoslaniCile:
Důvodem pro podání návrhu projektu je potřeba primárně se zabývat problematikou zdraví v chovech prasat, které je zejména v době vytváření podmínek pro chov s vysokou masnou užitkovostí nepříznivě ovlivňováno nemocemi polyfaktoriálního charakteru spolupůsobením širšího spektra mikroorganismů a stresujících faktorů prostředí. Nemocnost a tím i ekonomické ztráty v chovech jsou především spojovány s výskytem patogenních baktérií a mykoplazmat (mykoplazmové pneumonie, aktinobacilové pleropneumonie, dyzentérie aj.) bez znalosti o skutečném podílu virů v konkrétních případech onemocnění. Účelem řešení projektu je směřovat k vývoji a aplikaci metod přímého průkazu genetických struktur významných virových patogenů (PRRSV, PCV-2 a PPV), jak z biologických materiálů odebíraných od prasat intravitálně, tak z komplikovaných klinických vzorků, jako jsou orgány a tkáně uhynulých prasat, abortované plody, ejakuláty a inseminačních dávky kanců aj.
Tyto metody budou vyvíjeny v pracovních formátech, které umožní nejen viry specificky a citlivě detekovat a identifikovat na základě charakteristických genetických znaků, ale také kvantifikovat. V složitých podmínkách polymikrobiálního charakteru infekcí prasat je stanovení relativní koncentrace virů mimořádně významné pro posouzení typu infekce (aktivní, perzistentní), pro relevantnost ke klinickému průběhu onemocnění (u PCV-2 rozhodující kritérium) a pro sledování vlivu specifické i nespecifické imunostimulace na dynamiku replikace virů v organismu. Účelem projektu je též zabývat se problematikou zvyšení účinnosti imunoprofylaxe a prevence cirkovirových infekcí prasat a vyprodukovat antigenní proteiny PCV-2 s definovanou strukturou pomocí rekombiantních technologií a ověřit jejich účinek na průběh infekce po experimentálních infekcích SPF selat.
PoslaniIndikatory:
Očekávané přínosy navrhovaného projektu směřují do zabezpečení dalšího výzkumu virových infekcí prasat, zejména studia patogeneze cirkovirových infekcí prasat, odhalování cest šíření PCV-2 a pro kvantitativní hodnocení účinku nově vyvíjených preparátů při experimentálním ověřování jejich účinku na útlum nebo naopak stimulaci replikaci PCV-2/DNA v organismu. Aplikace definovaných rekombinantních proteinů PCV-2 v různých aktivních formátech pro stimulaci buněčné i humorální složky imunity ukáže v experimentálních podmínkách na směr dalšího výzkumu v oblasti specifické stimulace obranyschopnosti selat na onemocnění PMWS a odhalení faktorů zodpovědných za protekci před akutním průběhem cirkovirových infekcí prasat. Hodnocení experimentálních modelů bude možné provádět pomocí nově vyvíjených metod i v koninfekci s dalšími viry PRRSV a PPV. Ve výzkumu infekcí prasat virem PRRS bude přínosem inovovaná metoda RT-PCR v reálném čase pro studium perzistentní formy infekce kanců a sledování šíření viru semenem po zavedení specifické imunoprofylaxe živými nebo inaktivovanými vakcínami.
Řešením projektu budou získány i prakticky aplikovatelné přínosy ve formě nových účinných diagnostických metod s parametry splňujícící kritéria nejen dostatečné citlivosti a specificity, ale i potenciálu k identifikaci důležitých biologických znaků DNA nebo RNA virů využitelných k typizaci a vzájemné diferenciaci a k stanovení více mikroorganismů (např. DNA virů) z jedné analýzy. Tím dojde i k zlevnění detekčních postupů založených na konvenčním způsobu amplifikace nukleových kyselin. Specifické proteiny PCV-2 získané rekombinantní technologií budou také využity jako diagnostické antigeny v enzymatických imunoanalýzách a pro přípravu monospecifických antisér k ověření imunterapeutického účinku na potlačení příznaků PMWS u selat.
Pro chovatele bude bezprostředním přínosem rychlá a přesná identifikace zdrojů infekce tří nejvýznamnějších virů prasat (PRRSV, PCV-2 a parvoviru), kteří se nejvíce podílí na snížení obranyschopnosti prasat proti bakteriálním a mykoplazmovým patogenům. Inovace virologické diagnostiky založená na genetické identifikaci virů bude směřovat k provádění intravitálních analýz, ve fázi klinického průběhu onemocnění v chovu a v době karanténování před přesunem do jiného zařízení, a ne pouze z postmortálních vzorků jak se v současnosti nejvíce provádí. Chovatelé mohou získat přehled o rozsahu výskytu virů nejen ve vlastním chovu, ale i v jiných sledovaných regionech s ekonomickou návazností, což povede k zlepšení kontroly přesunovaných prasat a odhalování zdrojů šíření infekcí.
Vyvinuté pracovní formáty amplifikačních reakcí spolu s vhodnými vnitřními nebo externími standardy napomohou k rychlému zavádění těchto metodických postupů v diagnostických laboratořích a Státní veterinární správě umožní aktivní organizaci zdravotních programů v chovech prasat.
PoslaniOvereni:
Dosažené přínosy mohou být ověřeny formou publikací, které budou obsahovat metodický postup a použité pracovní formáty a systém standardů vyvíjených molekulárně virologických metod včetně výsledků získaných jejich využitím při analýze vzorků.
Vyvinuté a ověřené metody budou k dispozici formou kompletních operačních protokolů připravených pro akreditační řízení (nástroj ověření) a nebo ve formě sestavených diagnostických souprav pro diagnostické laboratoře, které jsou vybaveny termocyklery s fluorimetrickým zařízením.
CileCileCo:
Cílem je rozvoj a inovace kvantitativních metod molekulární identifikace cirkovirů, parvoviru a PRRSV pro stanovení významu virové etiologie polymikrobiálních infekcí prasat a pro kontrolu účinku specifických i nespecifických imunopreparátů.
Doba řešení
1.4.2005 - 31.12.2008
CileIndikatory:
Výsledkem bude vývoj, standardizace a validace kvantitativních metod genetické identifikace virů PCV-2, PRRS a PPV v biologických materiálech všech kategorií prasat. Vývoj metod na bázi PCR v reálném čase (“real-time” PCR), bude směřován nejen k citlivé a specifické detekci, ale k identifikaci důležitých genetických znaků mikroorganismů využitelných k typizaci a vzájemné diferenciaci, k stanovení více mikroorganismů z jedné analýzy a pro kvantifikaci virových patogenů v klinických materiálech odebraných z nemocných zvířat. Součástí bude produkce a aplikace souboru vnitřních a vnějších kontrol pro “real-time” PCR technologie využívaných pro kvantifikaci výše uvedených virů a k standardizaci a sjednocení postupů využívaných ve více laboratořích, dále jednoduché metodické postupy izolace virových nukleových kyseliny (DNA/RNA) z biologických materiálů z prasat, vhodné pro pracovní formát ”real time” RT-PCR a pro kvantitativní stanovení virů v analyzovaném vzorku.
Předpokládáme, že využitím těchto metod budou dosaženy výsledky, které v případě cirkovirových infekcí prasat přispějí k intravitální detekci cirkoviru typu 2 i cirkoviru typu 1 a k určení relevantnosti vysokých hladin cirkovirů k probíhací klinické formě onemocnění. Dosud není jasné, zda se infekce virem PCV-2 nepodílí kromě PMWS i na dalších formách onemocnění prasat, např. rození málo životných selat (podíl intrauterinních infekcí), nebo těžkém průběhu pleropneumonií u výkrmových prasat. Očekává se výsledek, který vnese jasnější představu o úloze cirkovirových infekcí u kanců a možnosti vylučování virů semenem a o dalších cestách šíření viru v chovech prasat.
Vývoj a zavedení metod k identifikace PPV a PRRSV povede k jejich využití k průkazu souběžných infekcí při studiu reprodukčních a respiračních poruch prasat a ve výzkumu vzájemných interakcí patogenů a jejich vlivu na dysfunkce imunitního systému. Pokud se podaří v průběhu řešení vyvinout systém rozdílného značení sond, je reálná možnost detekovat DNA dvou rozdílných virů (PCV-2 a PPV) současně v jednom vzorku. V případě viru PRRS je nutné dále pracovat na dostatečně citlivé metodě pro průkaz perzistentní formy infekce v semeni a lymfoidních orgánech kanců. Využitím kvantitativní metody RT-PCR se očekává výsledek, který by ekzaktně doložil imunoprofylaktický efekt vakcinace na vylučování viru PRRS semenem.
Výsledek vývoje a inovace kvantitativních metod genetické identifikace virů směřuje k zavedení přímých postupů hodnocení účinku a vlivu různých preparátů na potlačení replikace virů v organismu a na průběh onemocnění. Konkrétně v případě cirkovirových infekcí bude k dispozici přesnější kvantitativní metoda, jiná než imunohistochemická, s rozhodujícím významem pro posuzování vlivu preparátů využívaných k imunomodulaci nebo k specifické protekci proti bakteriálním a virovým patogenům. Proto cílem řešení projektu je bezprostředně využít výsledky metodického výzkumu k studiu vlastností definovaných strukturálních proteinů kapsidy PCV-2, a k zkoumání jejich vlivu na průběh infekcí a rozvoj klinických forem onemocnění v experimentech na prasatech. Rekombinantní proteiny PCV-2 produkované v prokaryontních a eukaryontních systémech budou využity k získání výsledků ve dvou oblastech: a)k produkci rekombinantních antigenů pro diagnostické enzymatické imunoanalýzy a k získání monospecifických antisér a monoklonálních protilátek k antigenním analýzám a k imunoprofylaktickým účelům, b)pro přípravu cirkovirového, strukturálniho „cap“ proteinu PCV-2 jako vakcinačniho antigenu speciálně konstruovaného k stimulaci buněčné složky imunity prasat pomocí inaktivních bakteriálních toxinů, nebo ve formě VLP částic („virus like particles“) produkovaných rekombinantními bakuloviry. Výsledkem bude monitorování účinku rekombinantních antigenů podaných SPF selatům na replikaci PCV-2 po experimentálních infekcích buď samotným PCV-2 izolátem, nebo v kombinaci s PPV nebo PRRSV. Efekt bude v této fázi experimentů posuzován podle kvantitativní metody detekce PCV-2 na bázi „real-time“ PCR, která umožní monitorovat dynamiku rozvoje replikativních forem v klinických vzorcích odebíraných intravitálně v průběhu pokusů a také v orgánech utracených SPF selat.